RFdiffusion2、LigandMPNN 与 BindCraft：2026 蛋白设计工作流

到 2026 年，蛋白设计已经不适合再用一条固定的“骨架生成 → 序列设计 → 结构预测”老流程概括所有任务。更实用的做法，是先按设计目标选择当前最匹配的方法。

本文只保留三条当前主线：

• RFdiffusion2：原子级、未预先指定序列位置的功能 motif scaffolding，重点面向酶活性位点等精确几何约束；
• LigandMPNN：显式感知小分子、核酸、金属等非蛋白原子环境的序列设计；
• BindCraft：面向 protein–protein interaction 的 de novo binder 设计。

1. 先按任务选方法

任务	当前优先入口	核心条件
酶活性位点 / 原子级 motif scaffolding	RFdiffusion2	功能原子几何、theozyme、配体或辅因子环境
围绕小分子、核酸、金属设计蛋白序列	LigandMPNN	蛋白骨架 + 非蛋白原子上下文
de novo 蛋白 binder	BindCraft	target structure，可选 hotspot

这三类方法解决的问题不同，不应按“版本新旧”互相替代。

2. RFdiffusion2：直接从原子级功能几何生成 scaffold

RFdiffusion2 于 2026 年发表于 Nature Methods。它最重要的进步是：可以直接接受原子级、未指定残基序列索引的 motif作为条件。

这对酶设计尤其重要。实际的催化约束往往不是“第 42 位必须是什么残基”，而是：

• 某几个催化原子必须保持特定距离和角度；
• 金属、辅因子或底物周围需要特定几何；
• 催化残基可以出现在序列中的不同位置；
• side-chain rotamer 也需要与功能几何共同确定。

RFdiffusion2 直接围绕这些原子级条件生成蛋白 scaffold，不要求用户预先固定每个 motif 残基在主链中的索引。

论文在 41 个活性位点 benchmark 中对全部案例获得了计算成功 scaffold，并进一步针对三类催化机制进行实验设计；每类实验测试少于 96 条序列即找到活性候选。

一个容易写错的点

虽然名字叫 RFdiffusion2，论文中的新模型训练使用的是 flow-matching objective，而不是简单沿用经典扩散训练目标。因此不要把它描述成“RFdiffusion 加几个功能模块”。

3. LigandMPNN：序列设计时显式看到非蛋白原子

LigandMPNN 于 2025 年发表于 Nature Methods。它的定位非常明确：在序列设计时显式建模蛋白周围的非蛋白原子环境。

包括：

• small molecules；
• nucleotides；
• metals；
• cofactors；
• 其他与设计位点直接接触的非蛋白原子。

论文报告，在与这些组分接触的残基上，LigandMPNN 的 native sequence recovery 明显提升；同时它还能预测 side-chain conformations，便于检查具体的原子相互作用。

因此，如果设计目标涉及：

• 酶活性口袋；
• 小分子 binder / sensor；
• DNA/RNA-binding protein；
• metal-binding site；

当前更合理的序列设计起点是 LigandMPNN，而不是忽略配体环境的通用 inverse-folding 模型。

4. BindCraft：当前更直接的 de novo binder 工作流

BindCraft 于 2025 年发表于 Nature，目标是从 target structure 出发，直接优化新的蛋白 binder 和界面。

它使用结构预测网络的可微分表示进行 binder hallucination，并在设计过程中共同优化：

• binder sequence；
• binder fold；
• binder–target interface。

用户可以提供 target hotspot，也可以让流程搜索潜在结合区域。

论文在 12 个目标上进行了实验测试，报告不同 target 的实验成功率为 10–100%，平均约 46.3%，并获得多种纳摩尔级 binder。

这些数字必须按论文条件理解，不能写成“BindCraft 对任何 target 都有 46% 成功率”。target 类型、设计长度、过滤设置和实验体系都会改变命中率。

为什么它值得单独列出来

对纯 protein–protein binder 任务，BindCraft 已经把设计和结构约束更紧地结合在同一优化过程中，因此比“先生成任意骨架、再单独猜序列、最后再看复合物”更直接。

但它仍然是计算设计方法，最终是否结合、亲和力多高、是否具有特异性，必须实验测量。

5. 2026 年更合理的模块化流程

不同任务应使用不同组合。

酶 / 活性位点设计

theozyme / atomic functional geometry
        ↓
RFdiffusion2 scaffold generation
        ↓
LigandMPNN sequence + side-chain design
        ↓
structure / geometry filtering
        ↓
expression + biochemical kinetics

小分子或核酸结合设计

protein scaffold + ligand / DNA / RNA context
        ↓
LigandMPNN sequence design
        ↓
complex-structure prediction / geometry checks
        ↓
binding + specificity experiments

Protein–protein binder

target structure
        ↓
BindCraft binder design
        ↓
independent computational filtering
        ↓
SPR / BLI / pull-down / cell assay

6. 结构预测过滤仍然不是实验验证

不论使用哪种设计方法，结构预测或模型打分只能回答：

• 设计序列是否与目标结构相容；
• 界面是否在计算上稳定；
• 关键原子几何是否保持；
• 候选之间哪一些更值得优先测试。

它不能直接证明：

• 蛋白可溶表达；
• 真实结合发生；
• 亲和力达到某个范围；
• 催化效率足够；
• 在细胞或植物体内具有目标功能。

特别是生成器和筛选模型共享结构数据库和表示先验时，模型间一致性不等于独立证据。

7. 不再使用跨项目固定阈值

不要把某篇论文中的 pLDDT、PAE、RMSD、ipTM 或 interface score 阈值复制成通用“及格线”。

更合理的是：

1. 根据具体任务选择指标；
2. 用已知阳性/阴性或论文复现集做校准；
3. 保留多个结构族和序列族，避免过度集中；
4. 根据实际实验预算确定过滤强度。

8. 植物和林木中的现实入口

对植物与环境生物学，当前最值得考虑的是有明确 readout 的任务，例如：

• 酶活性和底物范围改造；
• 植物激素或代谢物 binder / sensor；
• 病原效应蛋白或受体相关 binder；
• 污染物、金属或其他环境分子结合蛋白；
• 已知催化 motif 的 scaffold redesign。

如果没有可执行的结合、活性或表型实验，生成大量候选本身不会形成可靠生物学结论。

参考资料

• Ahern W, et al. (2026). Atom-level enzyme active site scaffolding using RFdiffusion2. Nature Methods 23:96–105.
• Dauparas J, et al. (2025). Atomic context-conditioned protein sequence design using LigandMPNN. Nature Methods 22:717–723.
• Pacesa M, et al. (2025). One-shot design of functional protein binders with BindCraft. Nature 646:483–492.
• RFdiffusion2 官方仓库
• LigandMPNN 官方仓库
• BindCraft 官方仓库